В 1665 г., после смерти своего отца Адама-Степана Мазепы, Мазепа получил звание черниговского подчашего. Затем, перейдя к казакам, Мазепа поступил на службу к гетману Дорошенко и дослужился до звания генерального писаря. Когда Мазепа увидел, что дело Дорошенко проиграно, он перешел на сторону Самойловича и сблизился с ним. Есть известие, что Мазепа был воспитателем детей Самойловича. При Самойловиче Мазепа сделался генеральным есаулом. Участие Мазепы в интригах и доносе на Самойловича не доказано. После свержения Самойловича на коломацкой раде 1687 г. Мазепа был избран гетманом. Избранием он был обязан подкупу князя В.В. Голицына и щедрым обещаниям, данным старшине. Последнего Мазепа вознаградил раздачей имений и полковничих и других должностей.

Как гетман-администратор Мазепа ничем не выделялся. Против него поднялось было народное восстание в 1692 г., под начальством Петрика Мазепы удалось усмирить его. Мазепа опирался на старшину, щедро раздавал ей имения; права крестьян при Мазепе истолковывались в ограничительном смысле. Покровительствовал также Мазепа духовенству, церквам и монастырям.

Отношения Мазепы к Москве были долгое время вполне корректными. Поездка в Москву, встреча с Петром в Киеве, беспрекословное исполнение распоряжений Петра I - все давало повод последнему считать Мазепу в числе преданных себе лиц. Мазепа умел использовать свое положение и устранять с дороги опасных и популярных в народе лиц. Так, он добился того, что организатор казачества на правом берегу Днепра, белоцерковский полковник Семен Палий, пользовавшийся большой популярностью, был сослан в Томск. Полагают, что первая мысль об измене явилась у Мазепы в 1705 г., когда он обсуждал ее с вдовой княгиней Дольской, урожденной Вишневецкой. Позже Мазепа вел переговор с ней же и с польским королем Станиславом Лещинским, а в октябре 1707 г. открылся своему генеральному писарю Филиппу Орлику. Переговоры велись тайно, и содержание их остается неизвестным. До самого последнего момента Мазепа сумел сохранить доверие Петра.

Доносы на Мазепу не раз посылались Петру из Украины. Он оставлял их без внимания. Весной 1708 г. донос на Мазепу отправил через своего родственника, полковника Искру, генеральный судья Василий Кочубей. Кочубей был раздражен на гетмана за романические отношения Мазепы к дочери Кочубея (об этом новые данные в книге Ф.М. Уманца и в "Заметках" А.М. Лазаревского ). Петр отдал доносчиков в руки Мазепы, и они были казнены.

Рассказ, будто бы Мазепа призвал Карла на Украину, не имеет твердых оснований. О переговорах Мазепы с самим Карлом ничего пока неизвестно. Движение Карла на Украину для Мазепы было, по-видимому, неожиданным. Когда шведский король вступил на территорию Украины, Мазепа с некоторыми полковниками передался на его сторону. Какое между ними состоялось соглашение, неизвестно. Из позднейших актов можно заключить, что Украина должна была оставаться свободной, сохранить целость границ и неприкосновенность своих привилегий.

Получив известие об измене Мазепы, Петр немедленно же распорядился об избрании гетмана. Гетманом был избран Иван Скоропадский. Мазепа был предан анафеме.

С полтавской битвой дело Мазепы оказалось проигранным. Он убежал вместе с Карлом и 18 марта 1710 г. умер в Бендерах. Тело его перевезли в Галац и похоронили в монастыре святого Георгия.